Πώς χρησιμοποιείται ο υπερήχων για την διάσπαση κυττάρων και την εξαγωγή DNA/RNA;

Πώς χρησιμοποιείται ο υπερήχων για την διάσπαση κυττάρων και την εξαγωγή DNA/RNA;

Ο υπερηχογράφος είναι μια αποτελεσματική και συνήθως χρησιμοποιούμενη τεχνολογία για τη διάσπαση κυττάρων και την εξαγωγή νουκλεϊκού οξέος (DNA/RNA).Η βασική αρχή του είναι να χρησιμοποιεί την επίδραση του κοιλότητας και τη μηχανική δόνηση για να καταστρέψει τη δομή των κυττάρων και να απελευθερώσει εσωτερικές ουσίεςΤο παρακάτω είναι μια εξήγηση από τον ειδικό μηχανισμό, τη διαδικασία εφαρμογής και τις βασικές προφυλάξεις:

Ι. Αρχή και διαδικασία του υπερήχων για τη διαταραχή των κυττάρων
Ο πυρήνας της κυτταρικής διαταραχής είναι η καταστροφή της κυτταρικής μεμβράνης (ζωικά κύτταρα) ή του κυτταρικού τοίχου + κυτταρικής μεμβράνης (φυτά, βακτήρια, μύκητες κλπ.) για την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών ουσιών (όπως νουκλεϊκά οξέα,πρωτεΐνεςΟ υπερηχογράφος επιτυγχάνει αυτή τη διαδικασία μέσω των ακόλουθων μηχανισμών:
1Βασική αρχή: επίδραση κοιλότητας
Ο υπερηχογράφος είναι ένα υψηλής συχνότητας μηχανικό κύμα με συχνότητα υψηλότερη από 20kHz.παράγεται δονήσεις υψηλής συχνότητας (συνήθως 15-50 kHz), το οποίο προκαλεί κοιλότητα στο υγρό μέσο:

Οι δονήσεις υψηλής συχνότητας προκαλούν τη δημιουργία μεγάλου αριθμού μικροσκοπικών φυσαλίδων (φουσάλες κοιλότητας) στο υγρό.και τελικά έσπασε βίαια (κατάρρευση).
Όταν οι φυσαλίδες εκρήγνυνται, απελευθερώνεται τεράστια στιγμιαία ενέργεια (τοπική υψηλή θερμοκρασία, υψηλή πίεση και ισχυρά κύματα σοκ),και η δύναμη της πρόσκρουσης που παράγεται θα σκίσει απευθείας τη μεμβράνη της δομής του κυττάρου (κυτταρική μεμβράνη, κυτταρικό τοίχωμα) για να επιτευχθεί κυτταρικό κατακερματισμό.
2Βοηθητική επίδραση: μηχανικές δονήσεις και δύναμη κοπής
Οι υψηλής συχνότητας μηχανικές δονήσεις των υπερήχων θα παράγουν επίσης άμεσα δύναμη κοπής και δύναμη τριβής στα κύτταρα, βοηθώντας περαιτέρω στην καταστροφή της κυτταρικής δομής,ειδικά για κύτταρα με παχύ κύτταρο (όπως μύκητες και φυτικά κύτταρα).
3. διαδικασία κατακερματισμού (παραλαμβάνοντας ως παράδειγμα την πειραματική λειτουργία)
Βάλτε το εναιώρημα κυττάρων που πρόκειται να αντιμετωπιστεί (όπως υγρό βακτηριακής καλλιέργειας, ομογενές ιστό κλπ.) σε ένα φυγοκεντρωτικό σωλήνα ή δοχείο, εισάγετε τον υπερηχητικό ανιχνευτή (κορνό),και ο ανιχνευτής πρέπει να βυθίζεται στο υγρό, αλλά όχι σε επαφή με το τοίχωμα του δοχείου.

Αναστρέψτε το υπερηχητικό όργανο και ρυθμίστε τις παραμέτρους (δύναμη, χρόνο κλπ.): οι δονήσεις υψηλής συχνότητας δημιουργούν φυσαλίδες καβιτάσης στο υγρό,και η δύναμη της πρόσκρουσης που παράγεται από την έκρηξη των φυσαλίδων καταστρέφει άμεσα την κυτταρική δομή και απελευθερώνει ενδοκυτταρικές ουσίες (συμπεριλαμβανομένων των νουκλεϊκών οξέων), πρωτεΐνες, μεταβολίτες κλπ.).
2- Ειδική εφαρμογή του υπερήχου στην εξαγωγή DNA/RNA
Τα βασικά βήματα της εκχύλισης DNA/RNA περιλαμβάνουν: διαταραχή κυττάρων για την απελευθέρωση νουκλεϊκών οξέων → αφαίρεση ακαθαρσιών (πρωτεΐνες, λιπίδια, πολυσακχαρίδια, κλπ.) → καθαρισμό των νουκλεϊκών οξέων.Ο ρόλος του υπερήχους επικεντρώνεται κυρίως στο πρώτο βήμα - την αποτελεσματική διαταραχή των κυττάρων και την απελευθέρωση νουκλεϊκών οξέωνΤα συγκεκριμένα σενάρια εφαρμογής και τα πλεονεκτήματα είναι τα ακόλουθα:
1. Κατάλληλοι τύποι δειγμάτων
Ο υπερηχογράφος είναι κατάλληλος για την εξαγωγή νουκλεϊνικού οξέος από διάφορα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων:

Τέστος ζώου (όπως συκώτι, μυς): πρέπει πρώτα να κοπεί σε μικρά κομμάτια, ο υπερήχιος μπορεί να διαταράξει γρήγορα τα κύτταρα και να απελευθερώσει νουκλεϊκά οξέα.
Βακτήρια/ μύκητες: τα κύτταρα είναι σχετικά σκληρά, οι παραδοσιακές μέθοδοι (όπως η θεραπεία με λυζοζάμι) είναι αναποτελεσματικές και ο υπερήχων μπορεί να καταστρέψει τα κύτταρα μέσω ισχυρού αποτελέσματος κοιλότητας.
Καλλιεργημένα κύτταρα (εμπνευσμένα ή αιωρούμενα κύτταρα): άμεση αιώρηση και έπειτα υπερήχων, χωρίς να απαιτείται σύνθετη προεπεξεργασία
Φυτικός ιστός: περιέχει κυτταρίνη και πεκτίνη, ο υπερήχιος μπορεί να βοηθήσει στην κατάρρευση των κυτταρικών τοιχωμάτων και την απελευθέρωση του περιεχομένου των κυττάρων.
2- Βασικές παραμέτρους λειτουργίας (που επηρεάζουν την ποιότητα των νουκλεϊκών οξέων)
Η υπερηχητική επεξεργασία απαιτεί αυστηρό έλεγχο των παραμέτρων για την αποφυγή της αποδόμησης του νουκλεϊκού οξέος ή του υπερβολικού κατακερματισμού (που επηρεάζει τα επακόλουθα πειράματα, όπως η PCR, η αλληλουχία κλπ.):

Δύναμη: συνήθως 50-300W (προσαρμόζεται ανάλογα με τον τύπο δείγματος, όπως τα βακτήρια απαιτούν μεγαλύτερη ισχύ).και πολύ χαμηλή ισχύς θα οδηγήσει σε ανεπαρκή κατακερματισμό.
Χρόνος εργασίας/διαστήματος: Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
Ολοκληρωτικός χρόνος θεραπείας: εξαρτάται από το δείγμα (όπως 1-3 λεπτά για τα κυττάρα ζώων και 3-5 λεπτά για τα βακτήρια).
Ελέγχος της θερμοκρασίας: λουτρό πάγου καθ'όλη τη διάρκεια της διαδικασίας (τα δείγματα τοποθετούνται στον πάγο), επειδή η υπερήχων διαδικασία θα παράγει θερμότητα (έκταση κοιλότητας συνοδευόμενη από τοπική υψηλή θερμοκρασία),χαμηλή θερμοκρασία μπορεί να αναστέλλει τη δραστηριότητα της νουκλεάσης και να προστατεύει τη σταθερότητα του νουκλεϊκού οξέος.

3. Πλεονεκτήματα και προφυλάξεις
Πλεονεκτήματα
Υψηλή αποδοτικότητα: Γρηγορότερη από τις παραδοσιακές μεθόδους (όπως το άλεμα, η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και η απόψυξη, η ενζυμική υδρόλυση) (συνήθως ολοκληρώνεται μέσα σε λίγα λεπτά) και πιο ενδελεχή διακοπή.
Οικουμενικότητα: Εφαρμόζεται σε διάφορους τύπους δειγμάτων (ζώα, φυτά, μικροοργανισμοί κλπ.) ·
Εύκολη λειτουργία: Δεν απαιτούνται σύνθετα αντιδραστήρια, απαιτούνται μόνο υπερηχητικά όργανα και βασικός εξοπλισμός φυγοκέντρωσης.
Προφυλάξεις
Αποφύγετε τις φυσαλίδες: Εάν υπάρχει μεγάλος αριθμός φυσαλίδων στο δείγμα, η αποτελεσματικότητα της επίδρασης κοιλότητας θα μειωθεί και ο ανιχνευτής μπορεί να υπερθερμανθεί.Βεβαιωθείτε ότι ο ανιχνευτής είναι εντελώς βυθισμένος στο υγρό (το επίπεδο του υγρού είναι περίπου 1-2cm);
Ανάστοχος της νουκλεάσης: Μετά τη διακοπή, πρέπει να προστίθεται εγκαίρως διάλυμα λύσης (συμπεριλαμβανομένου του EDTA, απορρυπαντικού κλπ.) για την αναστολή των ενδοκυτταρικών νουκλεάσεων (όπως η RNase που υποβαθμίζει εύκολα το RNA).
Ο όγκος του δείγματος: Ο ενιαίος όγκος επεξεργασίας δεν πρέπει να είναι πολύ μεγάλος (συνήθως ≤ 5 ml), διαφορετικά η κατανομή της υπερηχητικής ενέργειας θα είναι άνιση και το αποτέλεσμα διαταραχής θα ποικίλλει σημαντικά.

Σύνοψη
Ο υπερηχογράφος διαταράσσει αποτελεσματικά τα κύτταρα μέσω του αποτελέσματος του κοιλότητας και των μηχανικών δονήσεων, παρέχοντας ένα βασικό "βήμα απελευθέρωσης" για την εξαγωγή DNA / RNA.χρόνος και θερμοκρασία για να διαταράξουν πλήρως τα κύτταρα, μεγιστοποιώντας την προστασία της ακεραιότητας των νουκλεϊκών οξέωνΗ τεχνολογία αυτή χρησιμοποιείται ευρέως στο στάδιο της προεπεξεργασίας των πειραμάτων μοριακής βιολογίας (όπως κλωνοποίηση γονιδίων, qPCR, ανάλυση μεταγραφών κλπ.).) και είναι ένα σημαντικό εργαλείο για την εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων.